近日，深圳大学物理与光电工程学院生物医学光子学研究中心屈军乐教授团队在权威期刊《Nano Letters》（JCR一区TOP期刊，影响因子：10.8）发表题为“Super-resolution second-harmonic generation imaging with multifocal structured illumination microscopy”的研究论文，提出了利用多焦点结构光照明显微技术实现超分辨二次谐波成像的新方法，实现了多种生物组织中胶原纤维超分辨成像。张晨爽博士为该论文的第一作者，屈军乐教授和于斌教授为该论文的通讯作者，深圳大学为唯一完成单位。
二次谐波（SHG）是一种非侵入性成像技术，可在不使用外源标记的条件下探索生物组织的生理结构。然而，SHG成像的分辨率受衍射极限限制，阻碍了其在疾病诊断中的进一步应用。为了打破这一限制，本工作提出并发展了基于多焦点结构光照明的二次谐波超分辨成像（MSIM-SHG）技术，对氧化锌纳米颗粒成像，实现了147nm的横向分辨率和493 nm的轴向分辨率。通过对小鼠卵巢、肌肉、心脏、肾脏和软骨等多种生物组织中的胶原纤维排列进行量化研究，证明了MSIM-SHG有望成为临床诊断和生物学研究的有力工具。
图1. MSIM-SHG成像示意图。液晶空间光调制器加载一系列相位图（a），实现多焦点扫描（b），通过滤波、数字针孔及像素重定位处理，获得超分辨图像（c）。
本工作设计并搭建了二次谐波多焦点结构光照明显微成像系统，使用高速型近红外液晶空间光调制器对飞秒脉冲光进行相位调制，在物镜的焦面处生成多焦点照明阵列，使用阵列探测器相机探测二次谐波信号。相机的每个像素都可看作一个具有极小针孔的单像素探测器，由此可获得具有高分辨率的偏移共聚焦图像，其中偏移量为探测像素与照明点扩散函数之间的距离。通过图像后处理将照明焦点附近的像素值向着照明点扩散函数中心的方向移动，校正像素化探测带来的偏移（称为像素重分配）。重构后的图像不仅能够保持较高信噪比，而且还可实现约2倍分辨率的提高。此外，本工作提出了一种基于拉东变换快速提取胶原纤维排列角度的方法，可快速定量超分辨图像中胶原纤维的角度分布。
图2. MSIM-SHG系统及小鼠尾腱成像结果。（a）MSIM-SHG系统示意图。（b）宽场与MSIM图像对比，比例尺：5 μm。（c）对应的空间频率图像。细节图（d）及部分结构的强度分布曲线（e），比例尺：2 μm。
图3. 小鼠卵巢组织MSIM-SHG成像及胶原纤维角度分布曲线。（a）宽场与MSIM图像对比，比例尺：10 μm。细节图（b）及部分结构的强度分布曲线（c），比例尺：5 μm。（d）细节图中的胶原角度分布。
MSIM-SHG技术显著提高了SHG成像的分辨率，实现了小于衍射极限的生物分子如胶原纤维的可视化，结合拉东变换快速定量胶原纤维的排列，进一步推进了SHG成像技术在生物研究与疾病诊断中的应用。
该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、深圳市科技计划基础研究和深圳市重点实验室启动项目的支持。
论文原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.3c01903
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